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现代生物技术面面观
――科学研究与公众生活
逆转录病毒载体法
• 效率高
• 基因长度有限制（约8kb）
• 尽管载体设计成不能复制，但病毒基因组整合后转基因动物有可能生产病毒，因此要检查污染
∴ 一般不用于商品化转基因动物生产
显微注射法
• DNA损失少
• 无需选择标记基因（e. g. TK）
• 整合效率高
胚胎干细胞法
• 囊胚泡时期的细胞――保持分化特性
• 定点整合
• 正负筛选法
1983年，Ralph brinster (U Penn) 和Richard Palmiter（U Wash）创造第一只转基因鼠
? rat growth hormone gene
? metallothionein (MT) promoter
(activated by Cadmium)
人鼠（human mouse）
• Joseph M. McCune, Stanford Univ. 1988, SCID
• 胸腺 → 小鼠一个肾的被膜下，淋巴 → 另一个肾的被膜下
• 注射人的未成熟免疫细胞，如T-淋巴细胞等进循环系统
• 胸腺产生成熟细胞进入循环系统，来到淋巴结，在淋巴结组织内复制
人鼠的用途
• 检测是否引起人的免疫反应（如AIDS）
• 检测新药对HIV功能的抑制能力
原癌小鼠（oncomouse）
• 1988, Philip Leder, Harvard Univ.
• c - myc, 最早期研究其涉及淋巴瘤产生，而有mouse mammary tumor (MMT) virus存在时，c - myc 就会诱导乳腺癌
• c - myc + MMT virus section
• 成熟小鼠MMT 基因激活，打断c - myc基因的正常功能
• US Patent Number 4, 736, 866第一个高等动物的专利
• 1991年第二个专利授予该组，prostate mice (前列腺小鼠) int - 2 gene
敲 除 小 鼠
• 某一单个器官或器官系统被敲除
• 1985，Fox Chase Cancer Center (Philadelphia)发现一个基因缺失会使小鼠完全丧失产生B-和T-细胞的能力（SCID mouse）
• 某一单个基因被敲除
转基因猪
• 1991年，第一只转基因猪，生产人的血红蛋白
• 1000次注射，5个成功，3只猪成活
• 15%的红细胞含有人的血红蛋白，85%的含有正常的猪的血细蛋白
• 生化方法分开，纯化
• 在血液中几小时 ~ 几天，但如果交联欢可更稳定
• 纯血（约3000 CC），纯血红蛋白可完全发挥作用
动物生产的血红蛋白
• 无人类病源污染（HIV， hepatitis）
• 无需辨血型（因为无红细胞表面抗原）
• 可能污染动物病毒
• 动物细胞碎片可能引发过敏反应
器官移植
• 猪：大小形状、数目、常规化宰杀
• 1992年第一例器官（肝）移植(Cedars-Sinai Medical Center, CA)
• 转基因
• 安全性（猪的逆转录病毒等25种病）
• 克隆
乳腺生产蛋白的优点
• 量大，连续，于动物无害
• 医药蛋白对动物无副作用，翻译后修饰类似于人
• 纯化容易
转基因动物生产医用蛋白
• 转基因牛生产人的乳铁蛋白（荷兰）
• 转基因羊生产人的抗胰蛋白酶（苏格兰肺气肿）、CTCR (cystic transmembrane condutor regulator,美国CF)、TPA（美国，血栓）、antithrombin III（ 美国，血栓），疟原虫表面蛋白疫苗（美国，疟疾）
转基因动物生产医用蛋白
• 转基因小鼠 ―― 尿（两性均生产，活着就生产纯化容易）
• 孙同天（NY Univ.）,1995， uroplakins, HGH, 几百纳克HGH/ml尿
• 生产人的抗体
转基因克隆
• 1997年, 维尔穆特和坎贝尔（苏格兰罗斯林研究所） → 多莉（Dolly）
• 重建全能性
饥饿疗法5天
• 电泳冲融合
• 277/13/1 → 多莉
提出的问题
• 核已有一定年龄?
• 是否带有损伤，或未成熟
• 跟她母亲是否双胞胎
拯救濒危动物
• 克隆
• 安全性
• 多样性
植物的转基因方法
• 土壤农杆菌法
• 基因枪法
土壤农杆菌法
• Agrobacterium tumefaciens
• 冠瘿瘤（crown gall）
• 转移一段DNA
基 因 枪 法
• 打一枪即可
• 火药、气压等
• DNA随机插入
改变品质的转基因植物
• 1994年，英国的科研成果转PG反义基因的西红柿在美国问世
• 改变品质包括多方面：
营养、颜色、形状、花期等
改良植物品质和适应性
• 提高蛋白含量
• 提高必需氨基酸含量
• 推迟成熟耐贮存
• 改变植物花卉颜色
• 培育雄性不育植物
• 增加植物抗逆性
• 提高光合作用效率
提高品质质量
• 维生素A（三个基因同时转――量足够，过量无害）
• 淀粉（20-30%直链vs.70-80%支链）
淀粉分支酶（反义）
提高植物蛋白的营养质量
• 与肉相比，植物蛋白缺乏几种必需氨基酸
谷物中，赖氨酸（1.5-4.5%）和苏氨酸（2.7-3.9%）含量低，WHO推荐的食品含量分别为5.5%和4.0%
豆类中，含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）少，1.0-2.0% vs. WHO 3.5%
• 每年化学合成55万吨赖氨酸作为猪饲料添加剂
策 略
• 修饰蛋白质序列――贮藏蛋白
• 表达异源蛋白质――玉米Zein(S)，大豆BN2S(S)，向日葵SFA8(S)
• 提高游离EAA的水平――氨基酸合成途径（主要合成的酶都反馈抑制――突变）
• 同时提高EAA的源和库――游离氨基酸的生物合成途径（源）和蛋白质合成（库）
转基因抗虫植物
化学杀虫剂
• 长期使用害虫产生耐受性
• 杀虫特异性不高
• 环境危害
控制使用化学杀虫剂
• 使用生物杀虫剂
• 通过基因工程培育抗虫作物新品种
生物杀虫剂 vs 转基因抗虫作物
• 环境中的稳定性
• 施洒有时间性
• 害虫的摄食部位
两种主要策略
• 蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）或淀粉酶抑制剂（amylase inhibitor）
• 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）毒素蛋白
魔高一尺,道高一丈 (基因水平)
• 分离更多的新的B.t.毒蛋白基因
• 蛋白质工程改造B.t.毒蛋白基因 （domain swapping, codon preference）
• 多种抗性基因并存
（B.t. + PI, B.t. 1+ B.t. 2）
魔高一尺，道高一丈（大田水平）
• 轮换法（化学杀虫剂或抗虫基因作物）
• 避难所法
• 淘汰法（作物更新）
抗病毒转基因植物（1）
• 外壳蛋白介导的抗性――病毒复制的早期起作用
抗性强，抗性谱广
过量表达vs.反义（低浓度接种）
多种病毒――多个外壳蛋白基因同时使用
抗病毒转基因植物（2）
• 大肠杆菌rnc基因（RNase III）――双链RNA――突变酶（只结合不降解）――类病毒侵染（环状单链，之间形成双链）
• 美洲商陆抗病毒蛋白（春天PAP, 夏天PAPII, 种子PAP-S）――40％相似――核糖体60S失活蛋白――减少病毒斑的数目
转基因抗除草剂植物的策略
• 抑制植物对除草剂的吸收
• 过量表达对除草剂敏感的目标蛋白
• 降低目标蛋白与除草剂的结合能力
• 降解或使除草剂失活
目前在中国已获得商品化许可证
• 中国农科院的转B.t.基因抗虫棉
• 美国Monsanto公司的转B.t.基因抗虫棉
• 北京大学的转基因抗病毒甜椒
• 北京大学的转基因抗病毒番茄
• 北京大学的转基因改变花色矮牵牛
• 华中农大延迟成熟的转基因番茄
安全性如何？！
转基因植物对哺乳动物等高等生物，特别是对人是否有害？
B.t.毒蛋白原作用所需条件
• 微碱性环境（pH7.5至pH8.0）
• 特定的蛋白酶激活
• 特异的受体结合
转基因植物安全性社会焦点
• 社会伦理、宗教
• 生态学、进化
• 绿色和平组织
• 贸易壁垒
• 农业、消费者利益
科学 vs 政治
• 2001年11月12日，欧盟宣布了一项关于生物安全性问题的研究报告结果，这是欧盟国家以400个专家小组，花了6400万美元，历时15年研究出来的一份报告，其中没有一项单独的报告可以证明转基因食品给人类造成危害，报告同时还指出，运用优良的转基因技术及谨慎的监管可能比传统的食品更安全。而值得一提的是，在这份报告做出一年后，欧盟国家仍旧坚持不取消对美国转基因食品的禁令。
极端的反应？！
• 非洲的赞比亚正在面临饥饿的灾难，他们非常需要食品，但他们拒绝了美国给予的食品援助，转基因食品对他们而言比饥饿更可怕。
美国的情况
• 美国食品和药物管理局确定的转基因品种已有43种。美国是转基因食品最多的国家，60%以上的加工食品含有转基因成分，90%以上的大豆、50%以上的玉米、小麦是转基因的。转基因食品既有转基因植物，如西红柿、土豆、玉米等，也有转基因动物，如鱼、牛、羊等。
常问的问题
• 科学家修饰我们环境中的生物符合伦理标准吗？改变我们的食物来源在道德上正确吗？
• 作物的基因修饰本身有危险吗？
• 尽管有内在的安全保障，我们会不会无意中使我们的食物变得不安全了呢？
• 吃这种食品会有哪些长期后果呢？
• GM作物会影响环境或野生生态系统，从而减少作物的生物多样性、益虫，或珍贵的黑脉金斑蝶吗？
• 这些作物会导致有害的“超级杂草”的出现吗？
• 我们是否在未充分认识到了这一行动的后果的情况下将这种作物引入我们的环境吗？
• 会不会有基因污染呢？
• 这些基因会不会被转入包括人类和动物在内的其他生物体呢？
• 此外，还有更大甚至更重要的社会政治问题，例如对控制食物和农业系统的担忧，包括对全球化的普遍影响的疑问。
生物安全性问题
• 认识农业历史可以帮助消除消费者对GM食品的不安，还可使人们认识到社会背景与科学家的研究之间的关联。
• 从几千年来人类通过种植作物发展农业的方式，以及过去一个世纪以来我们培育现代作物品种的方式来看，绝大多数与目前的GM作物有关的风险问题都不是前无古人的。
• 问题不在于我们是否应修饰作物的基因，因为人类几千年前首次驯化植物时已走上了这条道路。我们需要权衡这种修饰对社会和环境的潜在后果，而不是简单地对我们改变基因的方式进行判断。
农业的起源
• 有关种植的最早证据可见于1万年前当今的伊拉克境内
• 在农业出现前的20万年时间里，人类游猎、采集和觅食，只能靠野生动植物生存。驯化开创了农业之先河，从而使人类社会发生了翻天覆地的变化。
• 在25万种开花植物中，早期人类必定尝试食用过其中几千种野生植物，然后才选中不到1千种植物进行人工栽培，使其适于耕作。
• 目前世界各地集中种植的作物品种仅有100种，而现在我们食用的大部分食物只是其中的很小一部分。
植物的表现型的重大变化
• 有限的生长习性
• 谷物不再脱落
• 同时成熟
• 较短的成熟期
• 苦味减轻和有害毒素的减少
• 种籽散失现象减少
• 抽芽和休眠
• 产量更高（包括种籽或果实更大），甚至还有无需种籽的植物，如香蕉。
改变的植物
• 这些变化降低了作物在野生环境中的生存能力。因此，我们的所有作物都有一个特点：野生植物中的杂草特性减弱了。目前作物的生存因而完全依赖于人类的照料，
植物驯化、引种和原产地
• 美国是世界上玉米和大豆的主要生产国，但这些作物其实分别源自墨西哥和中国。
• 世界上贸易量最大的商品咖啡原产于埃塞俄比亚，未受人青睐，但现在咖啡则大部分产自拉丁美洲和亚洲。
• 佛罗里达（Florida）橙子源于印度，而甘蔗则出自巴布亚新几内亚（Papua New Guinea）。
• 欧洲的土豆、印度的红辣椒、非洲的木薯，还有日本的白薯，但它们都是从南美洲引进的。
• 在北美洲，除了蓝莓、菊芋、向日葵和南瓜属植物外，所有的作物都是从其他地方引进的。
植物驯化、引种和原产地
• 中国醋栗在中国是野生品种，而且不可食用。但20世纪初它被引入新西兰 后，经过精心培育却变得十分可口，并被重新命名为“猕猴桃”。
• 大个的现代草莓是18世纪中叶美国弗吉尼亚州和智利的两个野生品种偶然在法国杂交的产物。
• 油菜籽在印度生长了好几个世纪，近一个世纪经过传统的人工育种发生了改变，消除了有毒的芥子酸和气味不佳的芥花油 （canola oil）。
• 黑小麦是一种全新的作物，几十年前通过人工合成法将小麦和黑麦的基因组合生成，而这两个各具特性的品种不会自然杂交。世界各地现有超过120万公顷的土地种植这种作物。
• 制做面包用的现代小麦本身也是一种比较新的作物，只是到了约4千年前，才通过四倍体硬粒小麦与无法食用的山羊草杂交而成。
A man who has food has several problems. A man without food has only one problem.
Western saying
We should not let our fears hold us back from pursuing our hopes.
J. Kennedy
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